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蛋白質含量測定中有效的四種方法

點擊次數:1007 發布時間:2019-04-28
蛋白質含量測定是指通過物理或化學方法對蛋白質含量進行測定。蛋白質是構成人體細胞和組織的重要成分,蛋白質含量測定是生物化學和分子生物學研究中常用、基本的分析方法之一。人體正常值一般是 60~80 g/L,準備待測蛋白質溶液,如血清蛋白等,用蒸餾水稀釋蛋白質溶液;如為固體蛋白質,應在105℃環境下烘幹。
蛋白質含量測定的操作方法
1.凱氏定氮法
準備4個50mL凱氏燒瓶並標號,想1、2號燒瓶中加入定量的蛋白質樣品,另外兩個燒瓶作為對照,在每個燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物,再加入濃硫酸,將4個燒瓶放到消化架上進行消化,之後進行蒸餾,全部蒸餾完畢後用標準鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量,直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色,即為滴定終點,結算出蛋白質含量。
2.雙縮脲法
雙縮脲法是個用比色法測定蛋白質濃度的方法,硫銨不幹擾顯色, Cu2+與蛋白質的肽鍵,以及酪氨酸殘基絡合,形成紫藍色絡合物,此物在540nm波長處有大吸收。首先利用標準蛋白溶液和雙縮脲試劑繪製標準曲線,將待測血清與硫酸鈉在待測試管中混合,並用隻加入硫酸鈉不含血清的試管作為對照,將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑,充分混合後於37℃環境中放置10分鍾,在540nm波長進行比色,以對照管調零,讀取吸光度值,由標準曲線上直接查出蛋白質含量。雙縮脲法常用於0.5g/L~10g/L含量的蛋白質溶液測定。
3.酚試劑法
取6支試管分別標號,前5支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液,後一支試管加待測蛋白質溶液,不加標準蛋白溶液,每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致,將液體混合均勻,在室溫下放置30分鍾,以未加蛋白質溶液的支試管作為空白對照,於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值
4.紫外吸收法
大多數蛋白質在280nm波長處有特征的大吸收,這是由於蛋白質中有酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸存在,可用於測定0.1~0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。取9支試管分別標號,前8支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液,1號試管不加標準蛋白溶液,後一支試管加待測蛋白質溶液,而不加標準蛋白溶液,每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致,將液體混合均勻,在280nm波長處進行比色,記錄吸光度值。
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