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一文帶你讀懂蛋白質測定標準的五種方法

點擊次數:144 發布時間:2019-04-15
蛋白質測定標準是一款芭乐app化的氮與蛋白質含量分析儀器,采用內置計算機控製,自動化完成蒸餾過程,大屏觸摸設置參數,隻需輕輕推至取放硝化管把手,安全把手硝化管置於工作部位,關閉亞克力安全門,自動完成加水、加堿與蒸餾,工作完成後自動關機並鳴音提示。
蛋白質測定標準主要有五種方法,分別是凱式定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法和酚試劑法
1.凱氏定氮法:
蛋白質是含氮的化合物。食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化,使蛋白質分解,產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨,留在消化液中,然後加堿蒸餾使氨遊離,用硼酸吸收後,再用鹽酸標準溶液滴定,根據酸的消耗量來乘以蛋白質換算係數,即得蛋白質含量。因為食品中除蛋白質外,還含有其它含氮物質,所以此蛋白質稱為粗蛋白。
2.雙縮脲定氮法:
在強堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物,稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵,或能過一個中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應。紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比,而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關,故可用來測定蛋白質含量。測定範圍為1~10mg蛋白質。幹擾這一測定的物質主要有:硫酸銨、Tris緩衝液和某些氨基酸等。
3.紫外吸收定氮法:
蛋白質分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵,使蛋白質具有吸收紫外光的性質。形成顏色產物的量取決於蛋白質的濃度。實際測定時,必須預先用標準蛋白質溶液製作一個標準校正曲線,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白質標準溶液。
不同濃度的標準蛋白質溶液加入雙縮脲試劑後,反應生成的顏色產物用紫外-可見分光光度計在540nm 波長下測定吸光度,以雙縮脲試劑加緩衝或水作空白對照。然後將測得的值分別對蛋白濃度(mg/ ml) 作圖,得標準曲線。
未知蛋白樣品用雙縮脲試劑做同樣處理,根據測得吸光度值在標準曲線上直接查得未知蛋白質樣品中得蛋白質濃度。進行紫外吸收法測定時,由於蛋白質吸收高峰常因pH的改變而有變化,因此要注意溶液的pH值,測定樣品時的pH要與測定標準曲線的pH相一致。
4.酚試劑法:
此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,隻是加入了第二種試劑,即Folin —酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深藍色的原因是:
①在堿性條件下,蛋白質中的肽鍵與銅結合生成複合物。
②Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產生深藍色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,藍色深度與蛋白的量成正比。
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